間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源於(yu) 早期中胚層的一類多能幹細胞, 在體(ti) 內(nei) 具有分布廣泛, 體(ti) 外能夠大量擴增和免疫原性低等特點, 是一種細胞治療的理想種子細胞。自20世紀60年代，Friedenstein等發現在人骨髓長期培養(yang) 中, 存在一種形態類似成纖維細胞的貼壁生長的細胞且移植到小鼠體(ti) 內(nei) 具有成骨能力和造血支持作用, 將這種細胞命名為(wei) 骨髓基質細胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世紀90年代末, 人們(men) 才成功分離一種具有成骨、成軟骨和成脂肪能力的細胞, 稱之為(wei) 間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。

      隨後研究者也從(cong) 其他組織, 如脂肪、臍帶、胎盤、肝髒、骨實質和肌肉等中成功分離獲得間充質幹細胞。作為(wei) 一類成體(ti) 幹細胞中的間充質幹細胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠這兩(liang) 種模式動物上, 其他動物的間充質幹細胞報道相對較少。選取中國*家禽品種鴨子為(wei) 實驗材料, 以鴨胚胎肝髒中的間充質幹細胞為(wei) 研究對象, 對其進行分離培養(yang) 鑒定, 進行增殖能力檢測及分化能力鑒定, 為(wei) 家禽幹細胞研究及畜禽遺傳(chuan) 資源保存提供借鑒及參考。鴨胚胎肝間質細胞進行慢病毒轉染8-12h，連續傳(chuan) 13代，采用高濃度含嘌呤黴素培養(yang) 基（4μg/mL）培養(yang) ，篩選陽性克隆；篩選出陽性永生化鴨胚胎肝間質細胞。

細胞培養(yang) 步驟

一．培養(yang) 基及培養(yang) 凍存條件準備：

1)準備鴨胚胎肝髒間充質幹細胞*培養(yang) 基（dmem 高糖和F12培養(yang) 基1：1搭配，10%血清 ，1%雙抗以及1％自己配置的間質細胞因子。）。

2)培養(yang) 條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yang) 箱濕度為(wei) 70%-80%。

3)凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲(chu) 存。

二．細胞處理：

1）複蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yang) 基混合均勻。在1000RPM條件下離心4-5分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養(yang) 基後吹勻。然後將所有細胞懸液加入T25培養(yang) 瓶中培養(yang) ，補加培養(yang) 基至6ml。

2）細胞傳(chuan) 代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳(chuan) 代培養(yang) 。

對於(yu) 貼壁細胞，傳(chuan) 代可參考以下方法：

1.棄去培養(yang) 上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於(yu) 培養(yang) 瓶中，置於(yu) 37℃培養(yang) 箱中消化1-2分鍾，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養(yang) 瓶後加2ml*培養(yang) 基終止消化。

3.輕輕打勻後吸出，在1000RPM條件下離心5分鍾，棄去上清液，加1-2mL培養(yang) 液後吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養(yang) 基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。