反應流程常規程序：

將PCR反應所需的成分配置完後，在PCR儀(yi) 上於(yu) 94-96℃預加熱幾十秒至幾分鍾，使模板DNA充分變性，然後進入擴增循環。在每一個(ge) 循環中，先於(yu) 94℃保持30秒鍾使模板變性，然後將溫度降到複性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鍾，使引物與(yu) 模板充分退火；在72℃保持1分鍾（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(ge) 循環。重複這樣的循環25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。最後，在72℃保持3-7min，使產(chan) 物延伸完整，4℃保存。

2．複性（退火）和延伸溫度

複性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guan) 鍵因素，通常在50-60℃之間。具體(ti) 的溫度主要由引物的Tm值決(jue) 定。延伸溫度絕大多數設定為(wei) 72℃。如果複性的溫度很高，可以將延伸溫度和複性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應時間

變性步驟一般使用30秒鍾，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。複性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chan) 物的大小決(jue) 定，一般采用1kb用1分鍾來保證充足的時間。

4．循環次數

循環次數主要與(yu) 模板的起始數量有關(guan) ，在模板拷貝數為(wei) 104～105數量級時，循環數通常為(wei) 25～35次。

平台效應（plateaueffect）：PCR擴增過程後期會(hui) 出現的產(chan) 物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產(chan) 生的焦磷酸會(hui) 出現末端產(chan) 物抑製作用，非特異性產(chan) 物或引物的二聚體(ti) 出現非特異性競爭(zheng) 作用，擴增產(chan) 物自身複性，高濃度擴增產(chan) 物變性不*。

5．PCR反應液的配製

PCR反應體(ti) 係的配置方式有時也會(hui) 影響反應的正常進行。常規方法與(yu) 其它酶學反應一樣，在最後加入DNA聚合酶。早期的PCR儀(yi) 沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發。

對於(yu) 使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會(hui) 擴增不出產(chan) 物。在遇到這個(ge) 問題時，如果將反應成分分開配製，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體(ti) 積的H2O，B管含緩衝(chong) 液、DNA聚合酶和水，然後再將兩(liang) 管溶液混合起來，可較好地克服這個(ge) 問題。

按照常規的方法配製反應體(ti) 係，有時會(hui) 出現非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決(jue) 這一問題。將dNTP、緩衝(chong) 液，Mg2+和primer先配製好，然後加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最後加入模板和DNA聚合酶等剩餘(yu) 成分。隻有當PCR反應進入高溫階段後，蠟層熔化，所有反應成分才會(hui) 混合在一起。