細胞克隆形成試驗是測定單個(ge) 增殖能力的有效方法之一。其基本原理是單個(ge) 細胞在體(ti) 外持續增殖6代以上時細胞數量已達60個(ge) 左右，此細胞群體(ti) 成為(wei) 克隆或集落，大小在0．3～1．0mm之間。通過計數克隆形成率，可對單個(ge) 細胞的增殖潛力做定量分析，了解細胞的增殖率和對生存環境的適應性。克隆形成率高者其獨立生存能力強，例如永生性細胞或癌細胞克隆形成率高，正常細胞則很低。常用的方法有平板克隆形成試驗和軟瓊脂克隆形成試驗。

一、材料

1．待測的培養(yang) 細胞。

2．細胞培養(yang) 液．0．25％，PBS溶液，Giemsa染色液。

3．培養(yang) 皿．吸管，培養(yang) 板。

4．CO2培養(yang) 箱，倒置顯微鏡。

二、方法

1．製備細胞懸液低密度細胞懸液一般根據需要配成]0~100個(ge) ／ml。取生長良好的對數生單層培養(yang) 細胞，吸出培養(yang) 瓶內(nei) 的培養(yang) 液，用0．25％消化並吹打成單個(ge) 細胞，把細胞懸浮在含10％牛血清RPMI 1640培養(yang) 液中備用。

2．接種和培養(yang) 用吸管輕輕吹打細胞懸液，使之混懸均勻後，將細胞懸液作梯度倍數稀釋，以適當的細胞密度(根據增殖能力)接種於(yu) 培養(yang) 皿中。一般分每皿50、100、200個(ge) 細胞的梯度密度分別接種於(yu) 含10ml 37℃預溫培養(yang) 液的培養(yang) 皿中，並輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃ 5％CO2及飽和濕度的環境下，靜置培養(yang) 2～3周。

3．觀察當培養(yang) 皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養(yang) 。棄去上清液，用PBS小心洗2次。加純甲醇或1：3醋酸／甲醇5ml，固定15min。然後棄掉固定液，加適量Giemsa應用染色液染10~30min，然後用流水緩慢洗去染色液，空氣幹燥。

三、結果分析

1.計算各皿克隆數將平皿倒置並疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大於(yu) 10個(ge) 的克隆數。

2．計算克隆形成率計算公式為(wei) ：

克隆形成率=克隆數／接種細胞數×100%

四、注意事項

1．克隆形成率與(yu) 接種密度有一定關(guan) 係，為(wei) 減少實驗誤差，細胞懸液中細胞應分散充分，單個(ge) 細胞比率至少在90％以上。此外，接種密度不能過大。

2．培養(yang) 期問應根據培養(yang) 液pH變化適當更換培養(yang) 液。

3．平板克隆形成試驗方法簡單，適用於(yu) 貼壁生長的細胞。

4．由於(yu) 細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yang) 細胞克隆形成率弱，傳(chuan) 代細胞係強；二倍體(ti) 細胞克隆形成率弱，轉化係強；正常細胞克隆形成率弱．腫瘤細胞強。