內(nei) 皮細胞(endothelial cell)在全部血管內(nei) 麵構成單一扁平上皮細胞層，呈多邊形，細胞的邊緣呈鋸齒狀，相互嵌合。用酶消化法或機械刮脫法等可將內(nei) 皮和平滑肌細胞分離，分離的內(nei) 皮細胞可在培養(yang) 的條件下生長。

一、原代培養(yang) 法

(一)灌注消化法

1．材料

(1)標本：兔主動脈。

(2)試劑和藥品：PBS、0．05％、培養(yang) 液、、、0．1％纖維連接蛋白、1．5％明膠。

(3)儀(yi) 器和材料：手術刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yang)

皿、培養(yang) 瓶、倒置顯微鏡、CO2孵箱、恒溫振蕩器。

2．方法

灌注消化法能夠獲得純度較高的內(nei) 皮細胞，是分離血管內(nei) 皮細胞的常用方法。

(1)取血管：在無菌條件下取出兔主動脈，用PBS衝(chong) 洗血管腔，洗去血液。

(2)消化內(nei) 皮細胞：將血管放入培養(yang) 皿中，從(cong) 動脈的一段插入靜脈置留針．結紮固定，然後用絲(si) 線將另一端結紮。通過靜脈置留針向血管內(nei) 注入消化液，至血管充盈為(wei) 止。在37℃條件下，消化10～15min。

(3)洗滌細胞：在血管的遊離端切口，收集消化液，然後用10ml培養(yang) 液衝(chong) 洗管腔。將消化液和衝(chong) 洗液離心(1000r／min,10min)。吸去上清液，用培養(yang) 液混懸細胞製成細胞懸液。

(4)包被培養(yang) 容器：在平皿或培養(yang) 瓶底部鋪纖維連接蛋白，鋪勻後靜置片刻，吸去剩餘(yu) 液體(ti) 即可。也可鋪明膠，培養(yang) 過夜，去除多餘(yu) 明膠。

(5)接種細胞：調整細胞懸液濃度為(wei) 3×105／ml，向25ml培養(yang) 瓶內(nei) 接種5ml，或直徑10cm的平皿則接種10ml。

(6)培養(yang) 細胞：置37℃、C02孵箱中培養(yang) ，每24h換液1次。以後每隔48h換液1次。約6d後細胞可融合成單層內(nei) 皮細胞。

3．結果觀察30min後內(nei) 皮細胞開始貼壁，細胞呈圓形或多邊形。12h後，可見細胞生長繁殖，呈小簇狀。24h後，細胞生長形成細胞群。1周後．每個(ge) 細胞群相互融合形成單量．細胞呈卵石狀排列。

4．注意事項向血管腔內(nei) 注入消化液時，應防止消化液溢出，以免消化血管外膜，引起成纖維細胞的汙染。

(二)酶消化法

1.材料

(1)標本：兔主動脈。

(2)試劑和藥品：PBS、0．2％膠原酶、培養(yang) 液、、、O．1％纖維連接蛋白、1．5％明膠。

(3)儀(yi) 器和材料：手術刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yang) 皿、培養(yang) 瓶、倒置顯微鏡、c。2孵箱、恒溫振蕩器。

2．方法

(1)取血管：在無菌條件下取出兔主動脈，放入盛有滅菌PBS的平皿中，剝除血管外的脂肪和纖維組織。

(2)暴露內(nei) 皮細胞：在盛有PBS的培養(yang) 皿中，縱向剪開血管壁，然後衝(chong) 洗。

(3)消化內(nei) 皮細胞：把血管放至盛有5ml膠原酶的平皿中，使血管內(nei) 膜麵朝下，置37℃、CO2孵箱中消化10～15min，並多次搖動平皿，以使內(nei) 皮脫落。消化近結束時，可在倒置顯微鏡下觀察。若大部分內(nei) 皮細胞已脫落，則將消化液移入離心管中。

(4)洗滌細胞：離心(1000r／min，10min)，吸去上清液；再加入5ml PBS懸浮細胞，再離心，吸去上清液。加入5ml培養(yang) 液懸浮細胞。

(5)包被培養(yang) 容器、接種細胞和培養(yang) 細胞同灌注消化法。

3．結果觀察培養(yang) 30min後，內(nei) 皮細胞貼壁。1周後，細胞生長形成單層，呈卵石狀排列。

4．注意事項放入培養(yang) 皿中的消化液不宜過多，避免消化內(nei) 皮以外的其他各層組織。

(三)機械刮脫法

1．材料

(1)標本：兔主動脈。

(2)試劑和藥品：PBS、培養(yang) 液、、、O．1％纖維連接蛋白、1．5％明膠。

(3)儀(yi) 器和材料：手術刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yang) 皿、培養(yang) 瓶、倒置顯微鏡、C02孵箱、恒溫振蕩器。

2．方法

(1)取血管：按酶消化法摘取長約20cm的大血管，在無菌條件下縱行剪開。

(2)洗滌血管：用PBS洗淨殘血，露出血管內(nei) 皮細胞。將血管固定在標本板上，內(nei) 皮朝上，再用PBS衝(chong) 洗2次。

(3)刮取內(nei) 皮細胞：用刮刀輕輕刮取內(nei) 膜表麵的內(nei) 皮細胞。刮取時，刮刀與(yu) 血管表麵成60°，輕柔而均勻地推進刮刀。每處隻能刮1次，不可刮血管的邊緣。

(4)洗滌細胞：刮下的內(nei) 皮細胞懸浮於(yu) 培養(yang) 液中，離心(1000r／min，10min)，吸去上清液；再加入15ml培養(yang) 液，用滴管輕輕吹打，以便分散細胞團，再離心1次，並吸去上清液。加入5ml培養(yang) 液懸浮細胞。

(5)包被培養(yang) 容器、接種細胞和培養(yang) 細胞同灌注消化法。

3．結果觀察30min後內(nei) 皮細胞開始貼壁，24h後，生長形成細胞群。1周後，細胞呈卵石狀排列。

4．注意事項刮內(nei) 皮時，不要過深和刮至血管斷麵處，以免引起成纖維細胞汙染。