製備感受態細胞：

1、從(cong) 37℃培養(yang) 16-20h的平板中挑取一個(ge) 單菌落（直徑2-3mm），轉到一個(ge) 含有100mlLB或SOB培養(yang) 基的1L燒瓶中。於(yu) 37℃劇烈振搖培養(yang) 3h。一般經驗，1OD600約含有大腸杆菌DH1×109個(ge) /ml。

    為(wei) 達到轉化，活數務必少於(yu) 108 細胞/ml，對於(yu) 大多數大腸杆菌來說，這相當於(yu) OD600值為(wei) 0.4左右。為(wei) 保證細菌培養(yang) 物的生長密度不致過高，可每隔15-20min測定OD600 來監測，用監測的時間及OD600 列一個(ge) 圖表，以便預測培養(yang) 物OD600值達到0.4的時間，當OD600值達到0.35時，收獲細菌培養(yang) 物。

    在菌株和菌株之間，OD600值與(yu) 每毫升活細胞數見的關(guan) 係變化很大，因此有必要通過測定特異大腸杆菌的生長培養(yang) 物在生長周期的不同時相的OD600值，並將各稀釋濃度的培養(yang) 物鋪於(yu) 物抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細胞數，從(cong) 而使分光光度計讀數得到標準化。

2、將細菌轉移到一個(ge) 無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培養(yang) 物冷卻至.0℃。

3、於(yu) 4℃用Sorvall GS3 轉頭以4100r/min離心10min，以回收細胞。

4、倒出培養(yang) 液，將管倒置1min以使zui後的痕量培養(yang) 液流盡。

5、每50ml初始培養(yang) 液用30ml預冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉澱。

6、於(yu) 4℃用Sorvall GS3 轉頭以4100r/min離心10min，以回收。

7、倒出培養(yang) 液，將管導致1min以使zui後的痕量培養(yang) 液流盡。

8、每50mo初始培養(yang) 物用2ml用並預冷的0.1mol/L CaCl2（或TFB）重懸每份細胞沉澱。

9、此時，可以按步驟10-16用新鮮製備的感受態細胞直接做轉化實驗，也可以將細胞凍存於(yu) -70℃。

轉化：

包括陽性和陰性對照

10、用冷卻的無菌吸頭從(cong) 每份用CaCl2溶液製備的感受態懸液中西區200ul轉移到無菌離心管（17*100mm）中，每管加入DNA（用不超過10ul的體(ti) 積，其中的DNA小於(yu) 50ng），輕輕旋轉以混勻內(nei) 容物，在冰中放置30min。

11、將管放入預加熱至42℃的循環水浴中，恰恰放置90s，不要搖動管。

熱激是一個(ge) 關(guan) 鍵步驟，準確地達到熱敷溫度非常重要。

12、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2min。

13、每管加800ulSOC培養(yang) 基，用水浴將培養(yang) 基加溫至37℃，然後將管轉移到搖床上，溫育45min，使細菌複蘇並表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。

    複蘇期中應於(yu) 37℃溫和地搖動細胞（用低於(yu) 50r/min轉速的搖床）。

14、將適當體(ti) 積（每個(ge) 90mm平板達200ul）已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的SOB瓊脂培養(yang) 基上。

    如果用四環素作為(wei) 選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個(ge) 單獨的平米上（或軟瓊脂中），可以現在微量離心機哈桑室溫離心20s以收集轉化菌，加100ulSOC重懸沉澱，輕輕混勻。

    重要：玻璃鋪菌器需先在乙醇在浸泡，然後在酒精燈上灼燒，待它涼至室溫後，才可將轉化菌輕輕地鋪在瓊脂板上。

    如檢查氨苄的抗性，用轉化菌鋪平板時密度應較低（每個(ge) 90mm平板不超過104菌落），於(yu) 37℃培養(yang) 的時間按不超過20h。氨苄抗性的轉化體(ti) 可將β-內(nei) 酰胺酶分泌到培養(yang) 基中，迅速滅活菌落周圍區域的。這樣，鋪平板時密度過高或培養(yang) 時間按過長都會(hui) 導致出血對氨苄敏感的衛星菌落。在選擇培養(yang) 基中不用氨苄而用羧苄，以及將抗生素濃度從(cong) 60ug/ml提高到100mg/ml,可使情況有所改善，但不能產(chan) 地*之。抗氨苄的增加與(yu) 平皿上所加的細菌數的增加並無線形比例關(guan) 係，這可能是因為(wei) 被抗生素殺死的釋放生長抑製物質的緣故。

15、將平板置於(yu) 室溫直至液體(ti) 被吸收。

16、倒置平皿，於(yu) 37℃培養(yang) ，12-16h後可出現菌落。