如果目前分離蛋白質組的技術是2-DE，那麽(me) 隨之而來的挑戰是數百數千個(ge) 蛋白如何被鑒定. 在這裏，我們(men) 不考慮傳(chuan) 統的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內(nei) 肽的化學測序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個(ge) 有機體(ti) 中有意義(yi) 的基因的過表達. 並不是因為(wei) 這些方法無效，而是因為(wei) 它們(men) 通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選. 目前，所選用的技術包括對於(yu) 蛋白鑒定的圖象分析、微量測序；進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析.

(1) 圖象分析技術(Image analysis). 

    “滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個(ge) 圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產(chan) 生，必須依靠計算機為(wei) 基礎的數據處理，進行定量分析. 在一係列高質量的2-DE凝膠產(chan) 生(低背景染色，高度的重複性)的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數據庫構建. 首先，采集圖象通常所用的係統是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機；激光密度儀(yi) (laser densitometers)和Phospho或Fluoroimagers，對圖象進行數字化. 並成為(wei) 以象素(pixels)為(wei) 基礎的空間和網格. 其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測. 利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義(yi) 的區域與(yu) 背景分離，限定斑點的強度、麵積、周長和方向.

    圖象分析檢測的斑點須與(yu) 肉眼觀測的斑點一致. 在這一原則下，多數係統以控製斑點的重心或zui高峰來分析，邊緣檢測的軟件可描述斑點外觀，並進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加度. 通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢複共遷移的斑點邊界. 以PC機為(wei) 基礎的軟件Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為(wei) 基礎的2-D分析軟件包. 第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化. 由於(yu) 在2-DE中出現100%的重複性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對於(yu) 圖象分析係統是一個(ge) 挑戰. IPG技術的出現已使斑點配比變得容易.

    因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量算法在長度和平行度觀測. 用來配比的軟件係統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被采用，而神經網絡、子波變換和實用分析在未來可被采用. 配比通常由一個(ge) 人操作，其手工設定大約50個(ge) 突出的斑點作為(wei) “路標”，進行交叉配比. 之後，擴展至整個(ge) 膠. 例如：的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個(ge) 或更多的已知蛋白所組成的標準曲線來計算未知蛋白的PI和MW. 在凝膠圖象分析係統依據已知蛋白質的pI值產(chan) 生PI網絡，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配.

    所估計的度大大依賴於(yu) 所建網格的結構及標本的類型. 已知的未被修飾的大蛋白應該作為(wei) 標誌，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0.25個(ge) 單位. 同理，已知蛋白的理論分子量可以從(cong) 數據庫中計算，利用產(chan) 生的表觀分子量的網格來估計蛋白的分子量. 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯後蛋白的出入更大. 故需聯合其他的技術完成鑒定. 

(2) 微量測序(microsequencing). 

    蛋白質的微量測序已成為(wei) 蛋白質分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息. 盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但zui普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術. 目前已實現蛋白質微量測序的自動化. 首先使經凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然後直接置於(yu) 測序儀(yi) 中，可用於(yu) subpicomole水平的蛋白質的鑒定.

    但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個(ge) 氨基酸的速率產(chan) 生；與(yu) 質譜相比，Edman降解消耗大；試劑昂貴，每個(ge) 氨基酸花費3～4$. 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分析成百上千的蛋白質. 然而，如果在一個(ge) 凝膠上僅(jin) 有幾個(ge) 有意義(yi) 的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序.

    近來，應用自動化的Edman降解可產(chan) 生短的N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用於(yu) Edman降解，業(ye) 已成為(wei) 一種強有力的蛋白質鑒定. 當對Edman的硬件進行簡單改進，以迅速產(chan) 生N-末端序列標簽達10～20個(ge) /d，序列檢簽將適於(yu) 在較小的蛋白質組中進行鑒定.若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質. 選擇BLAST程序，可與(yu) 數據庫相配比. 目前，采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用.