熒光原位雜交的染色體(ti) 分析

（一）標本的製備

1． 室溫下，依次用 70 ％、 90 ％和 100 ％的乙醇脫水 5min 。

2． 空氣幹燥載玻片。

3． 若短期使用，載玻片可在室溫貯存數天。若載玻片要保存，應在室溫下過夜使組織“老化”（ aged ），然後放入容器中，該容器密封於(yu) 含幹燥劑的塑料袋內(nei) ，－ 70 ℃保存。根據作者的經驗， 6 個(ge) 月內(nei) 使用的載玻片可貯存在－ 20 ℃。在雜交實驗之前解凍這些載玻片，不提倡反複凍融載玻片。

（二）缺口平移法標記探針

通過缺口平移法（酰）化 DNA 探針

1． 結合： 2 μ g 探針 DNA ， 10 μ l 10 ×反應緩衝(chong) 液， 10 μ l β－巰基乙醇， 10 μ l 核苷酸母液（ 0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5mmol/L dGTP, 0.5mmol/L -16-dUTP 和 0.12mmol/L dTTP ）， 20 單位 DNA 聚合酶 I 和 1 ： 1000 稀釋的 DNase I ，加雙蒸水至 100 μ l （zui後加酶）。

2． 在 15 ℃溫育 2h 。

3． 置反應混合物於(yu) 冰浴直至反應產(chan) 物的大小被確定。

4． 凝膠電泳檢測探針分子的長度：取 10 μ l 反應混合物，加入凝膠上樣緩衝(chong) 液，水浴箱中煮沸 2 3 分鍾使其變性，冰浴 3min ，上樣到 1 ～ 2 ％的瓊脂糖微型凝膠中，並以適當大小的標準品做對照，以 50V/cm 電泳 3min 。用濃度為(wei) 0.5 μ g/ml 的溴化乙錠染膠，在紫外透照儀(yi) 上顯示 DNA 並拍照。

5． 對於(yu) 的雜交條件，探針（可見一脫尾）應為(wei) 100 ～ 500nt 。根據電泳結果進行下述步驟：

a. 如果探針大小在期望的範圍內(nei) ，進行步驟 6 。

b.如果探針太大，可加入更多的 DNase I ，在 15 ℃溫育。

c.如果探針未*消化，純化探針並重複缺口平移法。

d. 如果探針太短，用較少的 DNase 重複反應。

6． 為(wei) 使 DNase 失活，加入 2 μ l 0.5mol/L EDTA 和 1 μ l SDS ，在 68 ℃加熱 10min 。

7． 用離心柱凝膠過濾法從(cong) 標記的探針中分離出未摻入的核苷酸：

a. 用 1ml 注射器裝入矽膠玻璃棉至 0.2ml 刻度處，加經緩衝(chong) 液平衡的 Sephadex G50 至 1ml 刻度處，將此柱置 15ml 的離心管內(nei) ，室溫下， 3000r/min 離心 6min 。

b. 去除過柱後的液體(ti) ，加入緩衝(chong) 液重複離心直至柱內(nei) 容物緊密充填至 1ml 刻度處，加 100 μ l 柱緩衝(chong) 液， 3000r/min 離心 6min ，重複洗滌步驟 3 次。在zui後一步洗滌後，確保流量與(yu) 上樣緩衝(chong) 液量相等，即 100 μ l 。

c. 探針溶液離心之前，放 1.5ml 的反應管在注射器下方的 15ml 管內(nei) ，與(yu) 前麵步驟相同，加探針液到柱內(nei) 並離心，過柱後的液體(ti) 收集在反應管中，這時已含有 20ng/ μ l 的標記探針。該探針已可用於(yu) 原位雜交或貯存於(yu) － 20 ℃。

用缺口平移法進行標記

與(yu) 缺口平移地化法幾乎相同，僅(jin) 10 ×寡核苷酸母液成分不同：

0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5 mmol/L dGTP, 0.125 mmol/L  -11-dUTP ， 0.375mmol/L dTTP 。

（三）斑點印跡分析法檢測標記物

1． 將分裝的 1 μ l 標準 DNA 稀釋液和同法配製的 1 μ l 待測 DNA 稀釋液點於(yu) 硝酸纖維素膜上。

2． 硝酸纖維素膜置 80 ℃真空烤箱內(nei) 1h 。

3． 室溫下，用 AP7.5 緩衝(chong) 液漂洗硝酸纖維素膜 1min 。

4． 將硝酸纖維素膜密封於(yu) 含 10ml 封閉液的塑料袋中，置 37 ℃溫育 30min 。

5． 打開塑料袋的一端，棄去封閉液，加入新鮮配製的鏈親(qin) 和素 - 堿性磷酸酶交  聯物溶液，重封塑料袋口，置 37 ℃溫育 30min 。6． 從(cong) 塑料袋中取出硝酸纖維膜，用 AP7.5 緩衝(chong) 液漂洗（室溫下兩(liang) 次各 5min ），再用 AP9.5 緩衝(chong) 液漂洗（室溫下 10min ）。

7． 將硝酸纖維素膜重封於(yu) 含顯影液的塑料袋中（ 33 μ l NBT 溶於(yu) 10ml AP9.5 緩衝(chong) 液中）。小心混勻後（不可漩渦混勻！）加入 25 μ l BCIP ，再次輕輕混勻反應液，在 37 ℃溫育直至顯影達滿意程度，一般 15 ～ 60min 。

8． 從(cong) 塑料袋中移去硝酸纖維膜，用 TE 緩衝(chong) 液終止顯色反應。

9． 空氣幹燥後，評估分析結果：測試組和對照組 DNA 的顏色密度應進行比較。在理想的雜交結果，zui低稀釋度信號應當是可見的。

（四）熒光標記原位雜交探針的混合與(yu) 變性

1． 混合 20 ～ 60ng 單拷貝 DNA 和 3 ～ 5 μ g 經剪切的鮭精 DNA （作為(wei) 載體(ti) ）。如果反應後體(ti) 積少於(yu) 10 μ l ，可凍幹；若體(ti) 積較大，可加入 1/20 體(ti) 積的 3mol/L 乙酸鈉和 2 倍體(ti) 積 100% 乙醇使 DNA 沉澱。混勻並置－ 70 ℃ 30min 。在 4 ℃用 Eppendorf 離心機以 12 000r/min 離心 10min ，棄上清，沉澱物以 500 μ l 70 ％乙醇漂洗後再離心（ 4 ℃， 12 000r/min, 10min ），棄上清並凍幹。

2． 重懸於(yu) 5 μ l 去離子的甲酰胺中，於(yu) 室溫漩渦混勻數分鍾。

3． 加 5 μ l 雜交緩衝(chong) 液，漩渦混勻 5 ～ 10min 。

4． 在 75 ℃使 DNA 探針變性 5min ，接著冰浴 5min ，這時探針已可用於(yu) 雜交。

（五）載玻片上 DNA 變性

變性

1． 在載玻片上選擇合適的雜交區，用鉛石筆在載玻片的另一麵作記號。

2． 變性前將載玻片置 60 ℃烤箱孵育以防止變性液加至載玻片時溫度的降低。

3． 加變性液至 Coplin 廣口瓶內(nei) ，在水浴箱中加熱至 70 ℃，用置於(yu) 瓶內(nei) 的溫度計檢測變性液的溫度（這是關(guan) 鍵步驟！）為(wei) 得到好的結果，溫度應達 70 ℃。

4． 將預熱的載玻片（一次不多於(yu) 3 片）移至含變性液的 Coplin 廣口瓶內(nei) 準 2min 。

5． 立即將載玻片依次移入含 70 ％、 90 ％和 100 ％乙醇（冰冷）的 Coplin 廣口瓶內(nei) ，各 5min 。

6． 空氣幹燥後，載玻片已可用於(yu) 雜交。

雜交

1． 將 10 μ l 含變性探針的雜交混合物加至載玻片的變性靶 DNA 上。

2． 在雜交的液滴上小心地蓋上 18 × 18cm 的蓋玻片，不要滯留氣泡。

3． 用橡皮泥將蓋玻片四周封好，置載玻片於(yu) 濕盒內(nei) ， 37 ℃溫育過夜。

（六）檢測

1． 分別在 42 ℃和 60 ℃的水浴箱內(nei) 預熱漂洗液 A （ 50 ％甲酰胺， 2 × SSC pH7.0 ）和 B （ 1 × SSC ～ 0.1 × SSC pH7.0 ）。

2． 從(cong) 濕盒內(nei) 取出載玻片，用鑷子小心除去橡皮泥。

3． 置載玻片於(yu) 含預熱至 42 ℃漂洗液 A 的 Coplin 廣口瓶中，在水浴箱中振蕩 10min 直至蓋玻片脫落，將載玻片移至另一含漂洗液 A 的廣口瓶中，振蕩 5min ，更換漂洗液 A 兩(liang) 次，每次振蕩 5min 。

4． 將載玻片移入含預熱（ 60 ℃）漂洗液 B 的 Coplin 廣口瓶中，漂洗 5min ，更換漂洗液兩(liang) 次，每次漂洗 5min 。

5． 將載玻片從(cong) Coplin 廣口瓶中取出，棄盡液體(ti) ，加 200 μ l 封閉液，蓋以 22 × 40mm 的蓋玻片，置濕盒內(nei) ， 37 ℃溫育至少 30min 。

6． 從(cong) 每張載玻片上移去蓋玻片，去除過的的液體(ti) ，加 200 μ l 帶熒光的報道分子檢測液（如 5 μ g/ml 與(yu) 熒光素偶聯的親(qin) 和素或 6 μ g/ml 與(yu) 羅丹明偶聯的抗抗體(ti) ），在 37 ℃濕盒內(nei) 溫育 30min 。所有的後序步驟均應在避光的 Coplin 廣口瓶中進行（如外裹錫箔紙）。

7． 移去蓋玻片，將載玻片移至漂洗液 C （ 4 × SSC ， 0.1 ％ Tween20 pH7.0 ）中，在 42 ℃（振蕩水浴箱）漂洗三次各 5min 。

8． 將載玻片置入含複染劑（如 2 × SSC ， 200ng/ml DAPI ）的 Coplin 廣口瓶中，室溫振蕩 20min 。

9． 將載玻片移至漂洗液 D （ 2 × SSC ， 0.05 ％ Tween 20 ）的 Coplin 廣口瓶中，室溫中溫育 1 ～ 2min 。

10． 從(cong) Coplin 廣口瓶中取出載玻片，加 20 ～ 30 μ l 防退色液並蓋以 22 × 40mm 的蓋玻片，置載玻片於(yu) 合適的盒內(nei) ，以便 4 ℃保存。

（七）染色體(ti) 原位抑製（ CISS ）雜交

1． 結合適量標記的探針 DNA ，人競爭(zheng) DNA （ Cot1 片段） 2 ～ 4 μ g ，加鮭精 DNA 至總量為(wei) 10 μ g DNA 。

2． 加 1/20 體(ti) 積乙酸鈉（ pH5.2 ）和 2 倍體(ti) 積的乙醇使 DNA 沉澱，置－ 70 ℃ 30min 。 12 000r/min 離心 10 分鍾後，大多數可見沉澱。棄上清並用 70 ％乙醇漂洗，再離心棄上清。

3． 凍幹樣本，重溶於(yu) 5 μ l 去離子甲酰胺中。

4． 加 5 μ l 變性緩衝(chong) 液。

5． 在 75 ℃溫育 5min 使 DNA 變性。

6． 迅速將含探針溶液的微量離心管移至 37 ℃，溫育 5 ～ 20min （甚至更長）使部分 DNA 再退火。

7． 預退火的探針與(yu) 變性 DNA 在載玻片上混勻。

8． 繼續進行（四，五，六）所述的步驟。

（八）信號放大

1． 小心地從(cong) 載玻片上移去蓋玻片。

2． 將載玻片移至漂洗液 C （ 4 × SSC ， 0.1 ％ Tween20 pH7.0 ）中，在 42 ℃漂洗三次共 10min 。

3． 從(cong) Coplin 廣口瓶中取出載玻片，吸去載玻片上的殘液，加 200 μ l 含 1 ～ 5 μ g/ml 化的抗親(qin) 和素抗體(ti) 的檢測緩衝(chong) 液，覆以 22 × 40mm 的蓋玻片，置濕盒內(nei) 在 37 ℃溫育 30min 。

4． 在 42 ℃含漂洗液 C 的 Coplin 廣口瓶中漂洗載玻片三次各 5min 。

5． 從(cong) Coplin 廣口瓶中取出載玻片，吸去載玻片上的殘液，加 200 μ l 含 5 μ g/ml 偶聯熒光染料的親(qin) 和素檢測緩衝(chong) 液。

6． 漂洗和染色體(ti) 步驟見（六）。

（九）多色熒光標記原位雜交

1． 在 DNA 沉澱之前，采用幾種與(yu) 不同報道分子結合的探針，而不是僅(jin) 用一種探針。

2． 合適的報道分子結合物必須加到檢測緩衝(chong) 液中（六）。每種報道分子結合物應與(yu) 一種熒光染料結合，該染料在光譜上能與(yu) 同一實驗所用的其它熒光染料相區別。