將純化的西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)製劑免疫BALB/c小鼠,用SP2/0骨髓瘤細胞與(yu) 經西瓜花葉病毒免疫的BALB/c小鼠的脾融合,有限稀釋法克隆和間接ELISA法篩選出1株穩定分泌西瓜花葉病毒單克隆抗體(ti) 的雜交瘤細胞株6C6。用間接ELISA方法對所獲得的雜交瘤細胞株進行亞(ya) 型鑒定為(wei) IgG1。間接ELISA方法測定腹水效價(jia) 為(wei) 1∶105。

    以單克隆抗體(ti) 為(wei) 包被抗體(ti) 、多克隆抗體(ti) 為(wei) 檢測抗體(ti) 的TAS-ELISA試劑盒與(yu) 引自ATCC的西瓜花葉病毒毒源PV-27、PV-379、PV-394、PV-511分離物均有反應,與(yu) 同屬的馬鈴薯A病毒(Potato virus A)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaicvirus virus)、李痘病毒(Plum pox virus)不發生交叉反應,與(yu) 同屬的番木瓜環斑病毒呈弱陽性反應口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的以感染偶蹄動物為(wei) 主的急性、熱性、高度傳(chuan) 染性疫病。該病的發生和流行嚴(yan) 重危害畜牧業(ye) 的健康持續發展,造成巨大的經濟損失,該病被世界動物衛生組織列為(wei) 必須通報的多種動物共患傳(chuan) 染病之一。

    從(cong) 2005年起國內(nei) 不斷發生牛口蹄疫,目前麵臨(lin) 著Asia 1型口蹄疫的持續危害、O型FMDV的複發感染、新型毒株A型的侵襲風險。因此,國內(nei) 口蹄疫的防控任務艱巨。我國防控FMD主要采取疫苗免疫和抗體(ti) 監測為(wei) 主的綜合防控政策,通過接種疫苗提高畜群整體(ti) 抗體(ti) 水平來預防口蹄疫的感染和傳(chuan) 播。因此牛口蹄疫感染的快速診斷、免疫效果評價(jia) 、自然感染和疫苗免疫的鑒別診斷成為(wei) 防控口蹄疫的關(guan) 鍵技術。
    本研究通過pPROEXTM HTb表達載體(ti) 在大腸杆菌DH5α中成功表達了FMDV的vp2基因,獲得大小為(wei) 35ku的融合蛋白,Western blot證實目的蛋白可與(yu) FMDV 5種血清型的牛陽性血清發生特異性反應。以此純化蛋白為(wei) 抗原建立了牛FMDV VP2蛋白間接ELISA方法。特異性試驗表明,該抗原不與(yu) 常見的7種牛病陽性血清發生交叉反應。檢測非免疫無口蹄疫地區牛陰性血清特異性為(wei) 100%;檢測感染血清敏感性為(wei) 97.3%;與(yu) 4種商品化試劑盒比較檢測O-Asia 1二價(jia) 滅活苗免疫牛血清364份,符合率分別為(wei) 69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。試驗結果表明建立的ELISA方法可用於(yu) 牛口蹄疫感染和免疫抗體(ti) 檢測。本研究利用實驗室融合表達的3B表位串聯肽(8BF)為(wei) 檢測抗原建立的間接ELISA為(wei) 基礎,優(you) 化組裝了一種特異、敏感的間接ELISA試劑盒。
    通過檢測大量未免疫、免疫健康牛血清和感染牛血清,確定了判定標準:S/P≥0.3,陽性;0.2≤S/P<0.3,可疑;S/P<0.2,陰性。8BF-ELISA試劑盒檢測NSP抗體(ti) 持續期試驗表明,自然感染牛3B表位肽感染後10個(ge) 月仍為(wei) 陽性。與(yu) 3種商品化試劑盒比較檢測101份臨(lin) 床樣本,和Ceditest? FMDV-NS ELISA、3ABC-I-ELISA符合率高達95%;與(yu) 3ABC-I-ELISA進一步比較檢測528份不同背景的牛血清,總符合率為(wei) 94.5%(499/528)。大規模檢測不同來源的6個(ge) 牛場共2026份臨(lin) 床牛血清,部分牛群全部陰性,大多數牛群含有陽性牛,陽性率從(cong) 3%到17%不等,個(ge) 別感染牛群陽性率高達72.2%。8BF-ELISA試劑盒方便、安全、實用,特異性和敏感性高,用於(yu) 鑒別診斷牛FMD自然感染和疫苗免疫,為(wei) FMD綜合防控提供了。