此法采用定量夾心酶聯免疫技術。抗體(ti) 具體(ti) 為(wei) WNT6已經被預先塗到微孔板。標準和樣品吸入井和任何WNT6目前被綁定的固定化抗體(ti) 。共軛的抗體(ti) 特異性WNT6除去任何未結合的物質後，加入到孔中。抗蛋白共軛的辣根過氧化物酶（HRP）的洗滌後，加入到孔中。經過洗滌，以除去任何未結合的抗蛋白的酶試劑，底物溶液加入到孔中，顯色成比例的量的初始步驟中的約束的WNT6。彩色顯影被停止並測量的顏色的強度。

   血清：使用血清分離管（SST）和全血標本在室溫下兩(liang) 小時或4℃過夜℃，然後離心15分鍾，在1000×g下。刪除上清即可檢測，或分裝和店內(nei) 樣品在-20°C或-80°C。但應避免反複凍融循環。

此法具有較高的靈敏度和特異性好，檢測鼠標WNT6。觀察鼠標WNT6和類似物之間無顯著交叉反應或幹擾。

精度： 

批內(nei) 精密度（內(nei) 檢測精度）：CV％<8％

三種已知濃度的樣品進行了測試20次在一個(ge) 平板上進行評估。

間精密度（精密檢測間）：CV％<10％

已知的三個(ge) 樣本20檢測到的濃度進行了測試評估。

樣品采集和存儲(chu) ：

等離子：采集血漿中EDTA或肝素作為(wei) 抗凝血劑。在2-8°C在30分鍾內(nei) 收集離心15分鍾，1000×G。即可檢測，或分裝保存樣本在-20°C或-80°C。但應避免反複凍融循環。

檢測程序：

在使用前，將所有試劑和樣品室溫。再次離心樣品解凍後測定前。據建議，所有樣品和標準來測定一式兩(liang) 份。

1。準備好所有試劑，工作標準和樣品在前麵的章節中。

2。請確定井數的使用，並把任何剩餘(yu) 的井和入袋幹燥劑，密封保鮮袋，將未使用的井在4°C的含量布局表

。每孔加入100μl的標準和樣品。封麵用膠粘帶提供。孵育2小時，在37℃下一盤布局記錄標準和樣品檢測。

4。每孔中取出的液體(ti) ，不洗。

5。向每孔中加入100μl抗體(ti) （1倍）。蓋上一個(ge) 新的膠粘帶。孵育1小時，在37℃下（抗體(ti) （1X）可能會(hui) 出現混濁。預熱至室溫，輕輕混勻，直到出現均勻解決(jue) 方案。）

6。吸液的各孔和洗滌，共洗滌三次重複該過程兩(liang) 次。洗淨，每孔填充洗滌緩衝(chong) 液（200μL）使用噴瓶，多道移液器，歧管器，或autowasher，和，靜置2分鍾，*清除液體(ti) 的每一步是*的良好的性能。zui後一次洗滌後，清除任何剩餘(yu) 洗滌緩衝(chong) 液的吸ordecanting。倒置板和塗抹對幹淨的紙巾。

7。向每孔中加入100μl的HRP-抗蛋白（1×）。量的微量滴定板，用一個(ge) 新的粘接劑條。溫育1小時，在37℃下

8。重複的願望/洗滌過??程中，在步驟6的5倍。

9。將90μlTMB底物添加到每個(ge) 孔中。孵育15-30分鍾，在37℃下避光

10。一站式解決(jue) 方案，每孔加入底物，輕輕晃動酶標板，以確保充分混合。

11。在5分鍾內(nei) ，設置至450nm，使用酶標儀(yi) 測定各孔的光密度。如果波長校正，設置為(wei) 540nm或570nm處。在540nm或570nm波長在450nm處的讀數減去讀數。該減法校正板的光學缺陷。在450nm處未經修正讀數直接，可能會(hui) 比較高，不太準確。

計算結果：

建議使用專(zhuan) 業(ye) 的軟“曲線專(zhuan) 家1.3”的標準曲線。
平均每個(ge) 標準和樣品的重複讀數和平均減去零標準的光學密度。

標準曲線，通過減少使用能產(chan) 生四參數邏輯（4-PL）的曲線擬合的計算機軟件的數據。作為(wei) 一種替代方法，建立標準曲線，對在y-軸的濃度通過繪製在x-軸為(wei) 每個(ge) 標準的平均吸光度，並繪製一個(ge) 通過在曲線圖上的點的zui擬合曲線。該數據可以通過繪製的WNT6濃度與(yu) 日誌的OD值和擬合直線的日誌，可以通過回歸分析確定線性化。此過程會(hui) 產(chan) 生足夠的，但不太的適合的數據。

如果已稀釋的樣品，從(cong) 標準曲線上讀出的濃度必須乘以稀釋因子。