預期應用ELISA法定量測定人血清、血漿、腦脊液或其它相關(guan) 液體(ti) 中Ach含量。

實驗原理
本試劑盒應用雙抗體(ti) 夾心酶標免疫分析法測定標本中Ach水平。用純化的抗體(ti) 包被微孔板，製成固相抗體(ti) ，往包被單抗的微孔中依次加入Ach、化的抗人Ach抗體(ti) 、HRP標記的親(qin) 和素，經過*洗滌後用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Ach呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配製 
1.         酶聯板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍幹品）：2瓶，每瓶臨(lin) 用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好後靜置10分鍾以上，然後反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 1000 nmol/L，做係列倍比稀釋後，分別稀釋成1000 nmol/L，500 nmol/L ，250 nmol/L，125 nmol/L，62.5 nmol/L，31.2 nmol/L，15.6 nmol/L，其原液直接作為(wei) zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為(wei) 標準濃度0 nmol/L，臨(lin) 用前15分鍾內(nei) 配製。

如配製500 nmol/L標準品：取0.5ml 1000 nmol/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨(lin) 用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔100ul），實際配製時應多配製0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內(nei) 配製。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨(lin) 用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標本的采集及保存

1．腦脊液：請離心後收集上清，並將標本保存於(yu) -20℃，且應避免反複凍融。

2．血清：標本請於(yu) 室溫放置2小時或4℃過夜後於(yu) 1000 x g離心20分鍾，取上清即可檢測，或將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為(wei) 抗凝劑，標本采集後30分鍾內(nei) 於(yu) 2 - 8° C 1000 x g離心15分鍾，或將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融。

注：標本溶血會(hui) 影響zui後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，餘(yu) 孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應120分鍾。

2.         棄去液體(ti) ，甩幹，不用洗滌。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鍾。洗板3次，350ul/每孔，甩幹。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鍾，洗板5次，甩幹。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鍾（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭(lan) 色，後3-4孔梯度不明顯）。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時蘭(lan) 色立轉黃色）。用酶聯儀(yi) 在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實驗留一孔作為(wei) 空白調零孔，該孔不加任何試劑，隻是zui後加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

2．為(wei) 防止樣品蒸發，試驗時將反應板放於(yu) 鋪有濕布的密閉盒內(nei) 。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nei) 的液體(ti) ；在實驗台上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將的洗滌緩衝(chong) 液至少0.4ml注入孔內(nei) ，浸泡1-2分鍾，根據需要，重複此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人Ach，且與(yu) 其它相關(guan) 蛋白無交叉反應。

計算
  以標準物的濃度為(wei) 橫坐標（對數坐標），OD值為(wei) 縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。

注意事項
1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控製在5分鍾內(nei) ，如標本數量多，使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時做標準曲線，做複孔。

4．  如標本中待測物質含量過高，請先稀釋後再測定，計算時請zui後乘以稀釋倍數。

5．在配製標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配製，不能混淆。

6．底物請避光保存。

檢測範圍：
15.6 nmol/L -1000 nmo/L

說明 
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期：6個(ge) 月

3．濃洗滌液會(hui) 有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．剛開啟的酶聯板孔中可能會(hui) 含有少許水樣物質，此為(wei) 正常現象，不會(hui) 對實驗結果造成任何影響。