細胞複蘇：

  1. 將新鮮置於(yu) 37℃水浴鍋中回溫，回溫後噴以75%酒精並擦拭之，移入無菌操作台內(nei) 。如配置：50mL*培養(yang) 基(含10%FBS，1%青雙抗) 44.5mL基礎培養(yang) 基+ 5mL FBS + 0.5mL青雙抗。

  2. 戴防護手套後，自液氮罐中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37℃水槽中快速解凍（避冰晶重新結晶而造成細胞死亡），輕搖冷凍管使其在2分鍾內(nei) 全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作台內(nei) 。

  3. 將解凍的1mL細胞懸液緩緩加入細胞培養(yang) 瓶內(nei) ，再向瓶中加入10mL*培養(yang) 基(稀釋比例為(wei) 1:10)，混合均勻，放入37℃，5%CO2的恒溫培養(yang) 箱中培養(yang) 。取0.1ml解凍胞懸液作存活測試。(Sf9細胞在27℃生長，可不需CO2) 

  4. 一般而言，細胞大都不需立即去除冷凍保護劑(例如DMSO)。若要立即去除，則將解凍的細胞懸液加入含有5-10ml培養(yang) 基之離心管內(nei) ，離1300rpm，5分鍾，移去上清液，加入新鮮培養(yang) 基，混合均勻，放入CO

  2培養(yang) 箱培養(yang) 。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yang) 後隔日更換培養(yang) 基。

傳(chuan) 代培養(yang) ：

1.37℃恒溫培養(yang) 約48小時，待細胞長滿80-90%後，從(cong) 培養(yang) 箱取出75cm

  2培養(yang) 瓶，倒掉培養(yang) 基。加入5mLPBS緩衝(chong) 液吹打以洗去殘留血清，倒掉緩衝(chong) 液。

   2.沿壁（無細胞的一麵）緩緩加入1mL溶液消化細胞約

1min，輕輕搖晃，倒掉殘餘(yu) ，將培養(yang) 瓶置於(yu) 恒溫箱中約1min，拿出培養(yang) 瓶輕輕拍打一下細胞貼壁的一麵。

  注意：消化溫度是37℃，加液後用移液管反複吹打分散細胞。

  3.向瓶中加入5mL*培養(yang) 基，反複吹打均勻2min，從(cong) 中取出至0.5ml小離心管中，向管中加入80μl台盼藍溶液，混勻，從(cong) 混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計數板上，計算細胞密度及活率。

   4.將5mL細胞懸液全部吸出，分別接種1mL懸液到原瓶和另一新的培養(yang) 瓶中，其餘(yu) 舍棄。再向兩(liang) 瓶中各加入10mL*培養(yang) 基，置於(yu) CO2培養(yang) 箱養(yang) 。（細胞傳(chuan) 代時按1：5或更大比例稀釋）