HRP的底物與(yu) AP的底物對比

1.AP為(wei) 磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate,p-NPP）作為(wei) 底物，可製成片劑，使用方便。產(chan) 物為(wei) 黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應後，黃色可穩定一時間。AP也有發熒光底物（磷酸4-甲基傘(san) 酮），可用於(yu) 作熒光測定，敏感度較高於(yu) 用顯色底物的比色法。 

2 HRP的底物 
HRP催化過氧化物的氧化反應，代表性的過氧化物為(wei) H2O2，其反應式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O 
上式中，DH2為(wei) 供氧體(ti) ，H2O2為(wei) 受氫體(ti) 。在Elisa中，DH2一般為(wei) 無色化合物，經酶作用後成為(wei) 有色的產(chan) 物，以便作比色測定。常用的供氫體(ti) 有鄰苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）和 ABTS[2,2’-azino-di-（3-ethylbenziazobine sulfonate-6）]。 
OPD氧化後的產(chan) 物呈橙紅色，用酸終止酶反應後，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物zui常用的底物。OPD本身難溶於(yu) 水，OPD·2HCL為(wei) 水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與(yu) 過氧化氫混合成底物應用液後更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2 一般分成二組分，OPD可製成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為(wei) 方便。過氧化氫則配入底物緩衝(chong) 液中，有製成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為(wei) 0.02% H2O2的應用液,隻需加入OPD後即可作為(wei) 底物應用液。

TMB經HRP作用後共產(chan) 物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩定，可配成溶液試劑，隻需與(yu) H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(you) 點，因此在Elisa中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止後，TMB產(chan) 物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，zui適吸收波長為(wei) 405nm。 
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為(wei) 一些試劑盒所采用。 
另一種HRP的底物為(wei) 3-（4-羥基）苯丙酸[3-（4-hydroxy）phenly propionic acid,HPPA]，經HRP作用後，產(chan) 物顯熒光，可用熒光光度計測量。用於(yu) Elisa的優(you) 點為(wei) 可加寬定量測定的線性範圍。 
HRP對氫受體(ti) 的專(zhuan) 一性很高，僅(jin) 作用於(yu) H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物（urea peroxide）。H2O2應用zui多，但尿素過氧化物為(wei) 固體(ti) ，作為(wei) 試劑較H2O2方便、穩定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解後，在底物緩衝(chong) 液中密閉、低溫（2～8℃）可穩定1年。

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