巨噬細胞炎性蛋白2星空体育官网中国操作步驟和注意事項

方法一　用於(yu) 檢測未知抗原的雙抗體(ti) 夾心法:

1、　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝(chong) 液將抗體(ti) 稀釋至蛋白質含量為(wei) 1～10μg/ml.在每個(ge) 聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nei) 溶液，用洗滌緩衝(chong) 液洗3次，每次3分鍾。(簡稱洗滌，下同)。

2、　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3、　加酶標抗體(ti) ：於(yu) 各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(ti) (經滴定後的稀釋度)0.1ml.37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

4、　加底物液顯色：於(yu) 各反應孔中加入臨(lin) 時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鍾。

5、　終止反應：於(yu) 各反應孔中加入2M硫酸0.05ml.

6、　結果判定：可於(yu) 白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內(nei) 顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為(wei) 無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀(yi) 上，於(yu) 450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔OD值，若大於(yu) 規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為(wei) 陽性。

試劑器材

1、　試劑

(1)　包被緩衝(chong) 液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝(chong) 液):

NaHCO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸餾水至1000ml

(2)　洗滌緩衝(chong) 液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0、2克

Tween-20　0.05%　0.5ml

加蒸餾水至1000ml

(3)　稀釋液：

牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

加洗滌緩衝(chong) 液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清與(yu) 洗滌液配成5～10%使用。

(4)　終止液(2M　H2SO4)：

蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml.

(5)　底物緩衝(chong) 液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml

0.1M 檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml

加蒸餾水50ml。

(6)　TMB(四甲基聯苯胺)使用液:

TMB(10mg/5ml無水乙醇) 0.5ml

底物緩衝(chong) 液(PH5.5) 10ml

0.75%H2O2 32μl

(7)　ABTS使用液:

ABTS 0.5mg

底物緩衝(chong) 液(PH5.5) 1ml

3%H2O2 2μl

(8)　抗原、抗體(ti) 和酶標記抗體(ti) 。

(9)　正常人血清和陽性對照血清。

2、　器材:

(1)　聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀(yi) ，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

(2)　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。

注意事項

1、　正式試驗時，應分別以陽性對照與(yu) 陰性對照控製試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2、　在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

(1)　固相載體(ti) 的選擇：許多物質可作為(wei) 固相載體(ti) ，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體(ti) ，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

(2) 包被抗體(ti) (或抗原)的選擇：將抗體(ti) (或抗原)吸附在固相載體(ti) 表麵時，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對於(yu) 多數蛋白質來說通常為(wei) 1～10μg/ml.

(3)　酶標記抗體(ti) 工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價(jia) 的滴定(見酶標記抗體(ti) 部份)。然後再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體(ti) 分別為(wei) 不同的稀釋度)在正式實驗係統裏準確地滴定其工作濃度。

(4)　酶的底物及供氫體(ti) 的選擇：對供氫體(ti) 的選擇要求是價(jia) 廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(ti) (如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體(ti) ，如TMB和ABTS是目前較為(wei) 滿意的供氫體(ti) 。底物作用一段時間後，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為(wei) 宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨(lin) 用前加入。