1. 標本的采取和保存
大部分ELISA 檢測均以血清為(wei) 標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會(hui) 釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP 為(wei) 標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會(hui) 增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌汙染，菌體(ti) 中可能含有內(nei) 源性HRP，也會(hui) 產(chan) 生假陽性反應。一般說來，在5 天內(nei) 測定的血清標本可放置於(yu) 4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解後，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻並避免產(chan) 生氣泡。混濁或有沉澱的血清標本應先離心或過濾，澄清後再檢測。反複凍融會(hui) 使抗體(ti) 效價(jia) 跌落，所以測抗體(ti) 的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
抗凝不*的標本因纖維蛋白原的幹擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
2.加樣
加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出。
3.保溫
在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩(liang) 次抗原抗體(ti) 反應一般在37℃經
1-2 小時，產(chan) 物的生成可達。為(wei) 避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。由於(yu) 公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(hui) 造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會(hui) 偏高，建議為(wei) 了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。
 4.洗滌
 洗滌在ELISA 過程中雖不是一個(ge) 反應步驟，但卻決(jue) 定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離遊離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與(yu) 固相抗原或抗體(ti) 結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附於(yu) 固相載體(ti) 的幹擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關(guan) 鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴(yan) 格按要求洗滌，不得馬虎。
 洗滌液多為(wei) 含非離子型洗滌劑的中性緩衝(chong) 液。聚苯乙烯載體(ti) 與(yu) 蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親(qin) 水基團，其疏水基團與(yu) 蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從(cong) 而削弱蛋白質與(yu) 固相載體(ti) 的結合，並借助於(yu) 親(qin) 水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回複到水溶液狀態，從(cong) 而脫離固相載體(ti) 。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高於(yu) 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體(ti) 解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率在1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解後配製。保證洗板浸泡時間為(wei) 40 秒左右，孔內(nei) 液體(ti) 被洗板機吸收得越幹淨洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nei) 形成氣泡。
5. 顯色和比色
TMB 經HRP 作用後，約40 分鍾顯色達，隨即逐漸減弱，至2 小時後即可*消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑製劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24 小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(hui) 使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標比色儀(yi) 簡稱酶標儀(yi) ，通常指於(yu) 測讀ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀(yi) 的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重複性、度和可測範圍、線性等等。優(you) 良的酶標儀(yi) 的讀數一般可到0.001，準確性為(wei) ±1%，重複性達0.5%。酶標儀(yi) 不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀(yi) 器15-30 分鍾，測讀結果更穩定。
測讀A 值時，要選用產(chan) 物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長。有的酶標儀(yi) 可用雙波長式測讀，即每孔先後測讀兩(liang) 次，次在zui適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩(liang) 次測定間不 移動ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為(wei) 兩(liang) 者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光幹擾。