HRP的氧化耦聯色原底物對主要有4—氨基：耦聯底物對（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯並噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯底物對（Ngo—Lenhoff試劑）等。
在H202存在下，4—氨基和經HRP作用縮合形成紅色的醌亞(ya) 胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收。
該耦聯色原底物對用於(yu) 固相ELISA時，敏感性一般較低，反應見光不穩定，而且易發生多聚化，缺乏適當的反應終止劑。因此，該試劑常限於(yu) 葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨(lin) 床生化指標的酶法檢測應用。1989年日本學者用其作為(wei) 色原底物建立了一種以HRP作標記酶的均相酶免疫試驗，可用甲醛終止反應。但這種方法僅(jin) 停留在實驗室階段，其後也未見有其他實驗室的應用報道，可能還有其固有的缺陷。
4—氨基：耦聯底物對色原底物的具體(ti) 配方為(wei) ①顯色底物溶液：將4—氨基以2 mmol／L，以25 mmol／L和H202以0．8 mmol／L的濃度溶於(yu) 0．1 mol／L磷酸鹽緩衝(chong) 液（pH7．2），即可應用；②終止液：未見報道；③測定波長：492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍色的吲達胺（indamine），zui大吸收波長為(wei) 590nm，見光不穩定。用鹽酸或硫酸終止反應後，pH應為(wei) 3．0左右，pH值的降低使顯色從(cong) 紫藍色轉變為(wei) 清晰的藍色，zui大吸收波長從(cong) 590nm變為(wei) 595nm，然而pH值的進一步降低，將導致光吸收消失。
MBTH：DMA耦聯對在固相ELISA測定幾乎沒有應用。
堿性磷酸酶（AP）
在測定中，堿性磷酸酶的色原底物zui常用的是對硝基苯磷酸鹽。在堿性磷酸酶的作用下生成對硝基酚（），其在入＝405 nm處有zui大吸收.
由於(yu) 堿性條件下的光吸收增強，並可使堿性磷酸酶失活，因而可使用碳酸鈉作為(wei) 終止劑。二乙醇胺緩衝(chong) 液中不能有單乙醇胺，因為(wei) 單乙醇胺對堿性磷酸酶有溫度依賴的抑製作用。較高濃度的無機磷可競爭(zheng) 性地抑製堿性磷酸酶的活性，貯存時間過長由於(yu) 非酶水解而產(chan) 生硝基酚和磷酸鹽時即可出現這種情況，此時呈黃色。
因此，用於(yu) ELISA測定時，必須五色。的摩爾消光係數（光吸收）的變化取決(jue) 於(yu) 溶液的pH及溫度、離子強度、蛋白含量，當溫度從(cong) 15~C升高至45℃時，在入＝405 nm處的光吸收將增加5％～7％。
在測定時，色原底物的具體(ti) 配方為(wei) ①顯色底物溶液：將以10 mmol／L的濃度溶於(yu) 含1 mmol／LMgCl：的0．1 mol／L二乙醇胺緩衝(chong) 液（pH 9．8），即可應用；②終止液：0．5 mol／L碳酸鈉；③測定波長：405nm。