免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體(ti) 分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應係統中抗原或抗體(ti) 的性質與(yu) 含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的ELISA試劑盒免疫檢測技術被稱為(wei) 3大免疫標記技術。目前，使用的免疫標記物還有化學發光物質、鐵蛋白和膠體(ti) 金等。
1.原理
辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)
辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著手從(cong) 辣根中分離此酶，以後又製備出結晶。本實驗是以辣根為(wei) 原料，經過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經鋅離子純化，透析除鹽，冰凍幹燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。
辣根過氧化物酶是一種含亞(ya) 鐵血紅素的蛋白質，HRP廣泛分布於(yu) 植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(ge) 同功酶組成，Mr在40000左右，等電點7.2。溶於(yu) 水，溶解度為(wei) 5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體(ti) 不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶於(yu) 水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶於(yu) 0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，ELISA試劑盒而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對愈創木酚為(wei) 氫給體(ti) 而言)。在室溫下，HRP幾周內(nei) 穩定，加熱到63℃，在15min內(nei) 穩定。氧化還原電勢很低，pH6.08時，E 0 =-0.2070V，pH為(wei) 7.71時，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為(wei) 403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。
酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體(ti) 和酶標記SPA等。酶標記物質量的好壞直接關(guan) 係到免疫酶技術的成功與(yu) 否，因此被稱為(wei) 關(guan) 鍵的試劑。酶標記物中zui常用的是酶標記抗體(ti) ，它是將酶與(yu) 特異性抗體(ti) 經適當方法連接而成。酶標記抗體(ti) 的質量主要取決(jue) 於(yu) 純度好、活性強及親(qin) 和力高的酶和抗體(ti) ，其次要有良好的製備方法。目前，高質量的酶(如辣根過氧化物酶，ELISA試劑盒簡稱HRP)國內(nei) 已有商品供應。高質量的抗體(ti) 則可通過提取純化而獲得。在製備方法上，宜選用產(chan) 率高、不影響結合物的活性和不混雜幹擾性物質且操作簡便易行的方法。
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