使用方法 ：   

1 實驗所需器材與(yu) 試劑

1.1 器材

1）PCR儀(yi)

2）PCR反應管

3）電泳儀(yi) 及水平電泳槽

4）高速離心機

5）微量移液器及移液器吸頭

1.2 試劑

1）瓊脂糖

2）EB（溴化乙錠）

3）去離子水或雙蒸水

反應五要素：

參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應的關(guan) 鍵，PCR 產(chan) 物的特異性取決(jue) 於(yu) 引物與(yu) 模板DNA互補的程度。理論上，隻要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體(ti) 外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為(wei) 20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為(wei) 宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為(wei) 宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個(ge) 以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nei) 部出現二級結構，避免兩(liang) 條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(hui) 形成引物二聚體(ti) ，產(chan) 生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個(ge) 堿基，應嚴(yan) 格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與(yu) 核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chan) 生所需要的結果為(wei) 好，引物濃度偏高會(hui) 引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體(ti) 的機會(hui) 。

注意事項：   

5.1使用本試劑前請仔細閱讀本說明書(shu) 全文。

5.2 操作時應盡量少說話，因口腔中也含有支原體(ti) ，可能引起樣品汙染，而造成假陽性；整個(ge) 檢測過程中，反應體(ti) 係的配製、樣本處理及加樣、PCR擴增應分區域進行，以避免交叉汙染。 5.3 實驗時，試劑盒組分中的試劑使用前應充分融化並混勻（混勻時禁止激烈振蕩，隻需要進行上下倒置多次進行混勻）。

5.4 反應管中加好所有的試劑後，應盡快上PCR儀(yi) 進行擴增，以免形成過多的二聚體(ti) 。