在中一般有兩(liang) 次抗原抗體(ti) 反應，即加標本和加酶結合物後。抗原抗體(ti) 反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為(wei) 溫育（incubation），有人稱之為(wei) 孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當。ELISA試劑盒屬固相，抗原、抗體(ti) 的結合隻在固相表麵上發生。
   以抗體(ti) 包被的夾心法為(wei) 例，加入板孔中的標本，其中的抗原並不是都有均等的和固相抗結合的機會(hui) ，隻有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與(yu) 抗體(ti) 接觸。這是一個(ge) 逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶標記抗體(ti) 與(yu) 固相抗原的結合也同樣如此。
洗滌： 
   洗滌在ELISA試劑盒過程中雖不是一個(ge) 反應步驟，但卻也決(jue) 定著實驗的成敗。ELISA試劑盒就是靠洗滌來達到分離遊離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與(yu) 固相抗原或抗體(ti) 結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附於(yu) 固相載體(ti) 的幹擾物質。
   聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。可以說在操作中，洗滌是zui主要的關(guan) 鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴(yan) 格按要求洗滌，不得馬虎。
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