熒光定量PCR技術是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產(chan) 物進行標記跟蹤，實時監控反應過程。隨著PCR反應的進行，反應產(chan) 物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個(ge) 循環，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產(chan) 物量的變化，結合相應的軟件對產(chan) 物進行分析，可以得到熒光擴增曲線，計算待測樣品初始模版的量。實時熒光定量PCR技術是一次由定性技術向定量技術的飛躍，運用該項技術，可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、定量和定性分析。

　　PCR試劑盒產(chan) 品及特點：

　　1.即開即用，用戶隻需要提供腸賈第蟲樣品。

　　2.根據腸賈第蟲保守序列設計的專(zhuan) 一性引物，與(yu) 相關(guan) 病毒無交叉反應。

　　3.靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

　　4.一管式熒光定量PCR檢測，避免後續汙染。

　　5.PCR試劑盒足夠50次20μL反應體(ti) 係的熒光定量PCR。

　　PCR試劑盒使用方法：

　　一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(ge) 10倍稀釋度為(wei) 例）

　　1.注意：由於(yu) 標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬(wan) 不能汙染樣品或本試劑盒的其他成分）。為(wei) 增加產(chan) 品穩定性和避免擴散傳(chuan) 染性病原，本產(chan) 品不提供活體(ti) 樣品做陽性對照，隻提供可以直接使用的DNA片段作為(wei) 陽性對照。

　　2.標記6個(ge) 離心管

　　3.用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

　　4.在7號管中加入5μL1×10E8拷貝/μL的陽性對照，充分震蕩1分鍾，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

　　5.換槍頭，在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鍾，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

　　6.換槍頭，在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鍾，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

　　7.重複上麵的操作直到得到6個(ge) 稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

　　二、樣品DNA的製備

　　8.如果有N個(ge) 樣品，必須設置N+2個(ge) 提取，多出的一個(ge) 是PC（樣品製備陽性對照），一個(ge) 是NC（樣品製備陰性對照）。可以用10μL上步製備的PCR陽性對照的第4號（濃度為(wei) 1×10E4拷貝/μL，10μL相當於(yu) 1萬(wan) 拷貝）或第5號（濃度為(wei) 1×10E5拷貝/μL，10μL相當於(yu) 10萬(wan) 拷貝）再加上一定量的水使總體(ti) 積跟每次製備要求的體(ti) 積一樣，以此作為(wei) PC。另外用水作為(wei) NC。如果每次製備需要200μL樣品，則PC和NC的體(ti) 積也必須是200μL。

　　9.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。

　　三、設置qPCR反應（20μL體(ti) 係，在樣品製備室進行）

　　10.如果隻做1次重複，則標記N+9個(ge) PCR管，其中N+2個(ge) 用於(yu) 上步得到的N+2個(ge) 樣品，1個(ge) 用於(yu) PCR陰性對照，6個(ge) 用於(yu) PCR陽性對照。如果做2-3次重複，則反應設置數量相應增加2或3倍。

　　11.在標記管中按下表加入各成分（本表隻列出一次重複。樣品管和陰性對照設置完畢後才設置陽性對照，並且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chu) 存好後加。