1）將培養(yang) 基在37℃水浴鍋預熱；準備一個(ge) 15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yang) 基。
2）將凍存細胞從(cong) 液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中複溫（可準備一潔淨的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出後迅速放入燒杯內(nei) ，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nei) 解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起汙染。
3）用75%酒精擦拭凍存管後再置於(yu) 超淨台內(nei) ，將管內(nei) 細胞轉移至準備好的離心管內(nei) ，輕輕吹打液體(ti) ，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chan) 生氣泡。用新鮮培養(yang) 基洗管壁2次，均轉移至離心管內(nei) 。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yang) 基，吹打製成細胞懸液。
5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內(nei) ，補加適量的培養(yang) 基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nei) 培養(yang) 。
6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yang) 基以去除死細胞。繼續培養(yang) ，待細胞長至80~90%匯合時正常傳(chuan) 代。一般剛複蘇的細胞需經過2~3次傳(chuan) 代，細胞活力恢複後才能進行後續的實驗。
商品描述：
產(chan) 品名稱 | 上皮細胞專(zhuan) 用培養(yang) 基 | 規格 | 500ml |
用途 | 僅(jin) 供科研研究實驗 | 貨號 | EY-XP4260 |
產(chan) 品介紹
原代上皮細胞培養(yang) 體(ti) 係是一個(ge) 為(wei) 體(ti) 外生長的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳動物的柱狀上皮細胞設計的理想的培養(yang) 基方案。本體(ti) 係是一個(ge) 基於(yu) 碳酸氫鹽的緩衝(chong) 體(ti) 係，可以在孵育的5%的CO2的氣體(ti) 環境下維持一個(ge) 圍繞pH7.2的酸堿緩衝(chong) 體(ti) 係。本體(ti) 係是一個(ge) 無菌的液體(ti) 混合係統，其中包含必須和非必須氨基酸、維生素、激素、生長因子、微量元素和一些其他的有機和無機化合物以及一個(ge) 低濃度的胎牛血清（2%）。本培養(yang) 體(ti) 係是基於(yu) 固定配方配製的液態培養(yang) 體(ti) 係，可以為(wei) 體(ti) 外培養(yang) 的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳動物的柱狀上皮細胞提供一個(ge) 確定適宜的平衡營養(yang) 環境，並且可以選擇性的促進柱狀上皮細胞的擴增。
運輸和保存
放置於(yu) 含有生物冰袋的保溫箱中低溫運輸
產(chan) 品使用
1.本產(chan) 品僅(jin) 能用於(yu) 科研
2.本產(chan) 品未通過直接用於(yu) 活體(ti) 動物和人的審核
3.本產(chan) 品未通過用於(yu) 活體(ti) 診斷的審核
注意事項：
僅(jin) 限科研用。
培養(yang) 體(ti) 係中的一些組分是對人體(ti) 健康有害的物質，請不要用暴露的皮膚接觸培養(yang) 體(ti) 係的液體(ti) 和有培養(yang) 體(ti) 係的液體(ti) 殘留的容器內(nei) 部；這部分有害物質的濃度和危害性都較低，如有接觸，立即用自來水衝(chong) 洗即可。
細胞培養(yang) 步驟：
一．培養(yang) 基及培養(yang) 凍存條件準備：
1） 準備DMEM-H培養(yang) 基(添加NaHCO3 1.5g/L)，90%；胎牛血清，10%。也可根據實驗需要選擇懸浮培養(yang) 基，使293T細胞懸浮生長。
2） 培養(yang) 條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yang) 箱濕度為(wei) 70%-80%。
3） 凍存液：90%培養(yang) 基，10%DMSO，現用現配。液氮儲(chu) 存。
二． 細胞處理：
1） 複蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yang) 基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養(yang) 基後吹勻。然後將所有細胞懸液加入培養(yang) 瓶中培養(yang) 過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yang) 基，培養(yang) 過夜）。第二天換液並檢查細胞密度。
2） 細胞傳(chuan) 代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳(chuan) 代培養(yang) 。
對於(yu) 貼壁細胞，傳(chuan) 代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yang) 上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於(yu) 培養(yang) 瓶中，置於(yu) 37℃培養(yang) 箱中消化1-2分鍾，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養(yang) 瓶後加少量培養(yang) 基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補加培養(yang) 基，輕輕打勻後吸出，在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養(yang) 液後吹勻。
4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yang) 基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yang) 基後加入少量，細胞變圓脫落後，加入約1ml含血清的培養(yang) 基後加入凍存管中，再添加10%DMSO後進行凍存。
冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置於(yu) 4℃ 30~60 分鍾→ （-20 ℃30 分鍾*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲(chu) 存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置於(yu) 已設定程序之可程序降溫機中每分鍾降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chu) 存。-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
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