人脂肪幹細胞永生化

1. 收到細胞後首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yang) 液是否有漏液、渾濁等現象，幹冰運輸的細胞檢查幹冰是否*揮發，細胞是否解凍，若有上述現象發生請及時和我們(men) 聯係。

2. 仔細閱讀細胞說明書(shu) ，了解細胞相關(guan) 信息，如細胞形態、所用培養(yang) 基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yang) 條件一致，若由於(yu) 培養(yang) 條件不一致而導致細胞出現問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表麵，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題，部分細胞由於(yu) 溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現象。.觀察好細胞狀態後，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於(yu) 37℃培養(yang) 箱放置2-4h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yang) 基重懸細胞，並接種到新的培養(yang) 瓶或培養(yang) 皿中，置於(yu) 培養(yang) 箱中進行培養(yang) 。

5. 請客戶用相同條件的培養(yang) 基用於(yu) 細胞培養(yang) 。

6. 建議客戶收到細胞後前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便於(yu) 和我司技術部溝通交流。由於(yu) 運輸的原因，個(ge) 別敏感細胞會(hui) 出現不穩定的情況，請及時和我們(men) 聯係，告知細胞的具體(ti) 情況，以便我們(men) 的技術人員跟蹤回訪直至問題解決(jue) 。

7. 該細胞僅(jin) 供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yang) 基(灌液培養(yang) 基)不能再用來培養(yang) 細胞，請換用按照說明書(shu) 細胞培養(yang) 條件新配製的*培養(yang) 基來培養(yang) 細胞。 收到細胞後次傳(chuan) 代建議1：2傳(chuan) 代 。

9. 注意： 1:2傳(chuan) 代就是1個(ge) T25瓶傳(chuan) 2個(ge) T25瓶或者2個(ge) 6cm皿。不是1個(ge) T25瓶傳(chuan) 2個(ge) 10cm皿。

1)複蘇細胞：將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yang) 基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yang) 基後吹勻。然後將所有細胞懸液加入含適量培養(yang) 基的培養(yang) 瓶中培養(yang) 過夜(或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yang) 基，培養(yang) 過夜)。第二天換液並檢查細胞密度。

2)細胞傳(chuan) 代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳(chuan) 代培養(yang) 。

a、棄去培養(yang) 上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)於(yu) 培養(yang) 瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養(yang) 瓶置於(yu) 37℃培養(yang) 箱中消化1-2 min(視細胞情況而定)，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養(yang) 瓶後加2-3ml*培養(yang) 基終止消化。輕輕打勻後裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yang) 液後吹勻。

c、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yang) 基的新皿中或者瓶中，置於(yu) 培養(yang) 箱中培養(yang) 。

3)細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下麵 T25 瓶為(wei) 例;

a、收集細胞及細胞培養(yang) 液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h後轉入液氮灌儲(chu) 存。記錄凍存管位置以便下次拿取。