1）將培養(yang) 基在37℃水浴鍋預熱；準備一個(ge) 15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yang) 基。
2）將凍存細胞從(cong) 液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中複溫（可準備一潔淨的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出後迅速放入燒杯內(nei) ，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nei) 解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起汙染。
3）用75%酒精擦拭凍存管後再置於(yu) 超淨台內(nei) ，將管內(nei) 細胞轉移至準備好的離心管內(nei) ，輕輕吹打液體(ti) ，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chan) 生氣泡。用新鮮培養(yang) 基洗管壁2次，均轉移至離心管內(nei) 。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yang) 基，吹打製成細胞懸液。
5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內(nei) ，補加適量的培養(yang) 基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nei) 培養(yang) 。
6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yang) 基以去除死細胞。繼續培養(yang) ，待細胞長至80~90%匯合時正常傳(chuan) 代。一般剛複蘇的細胞需經過2~3次傳(chuan) 代，細胞活力恢複後才能進行後續的實驗。
商品描述：
產(chan) 品名稱 | MEGM kit培養(yang) 基 | 規格 | 500ml |
用途 | 僅(jin) 供科研研究實驗 | 貨號 | EY-XP4251 |
產(chan) 品介紹
MEGM kit 培養(yang) 基 （Lonza/Clonetics,-3150）備注：培養(yang) 基包含（A+B）
A : MEBM基礎培養(yang) 液 500ml
保存條件：2-8℃
B: 細胞生長添加劑 5管 5管
1) 4009G BPE 2.0ml
2) 4017G hEGF 0.5ml
3) 4021G INSULIN 0.5ml
4) 4031G HYDROCORTISONE 0.5ml
5) 4081G GA-1000 0.5ml
保存條件 ：-20℃
運輸和保存
放置於(yu) 含有生物冰袋的保溫箱中低溫運輸（儲(chu) 存條件2-8℃ 避光儲(chu) 存）產(chan) 品保質期12個(ge) 月。
注意事項：
僅(jin) 限科研用。
培養(yang) 體(ti) 係中的一些組分是對人體(ti) 健康有害的物質，請不要用暴露的皮膚接觸培養(yang) 體(ti) 係的液體(ti) 和有培養(yang) 體(ti) 係的液體(ti) 殘留的容器內(nei) 部；這部分有害物質的濃度和危害性都較低，如有接觸，立即用自來水衝(chong) 洗即可。
細胞培養(yang) 步驟：
一．培養(yang) 基及培養(yang) 凍存條件準備：
1） 準備DMEM-H培養(yang) 基(添加NaHCO3 1.5g/L)，90%；胎牛血清，10%。也可根據實驗需要選擇懸浮培養(yang) 基，使293T細胞懸浮生長。
2） 培養(yang) 條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yang) 箱濕度為(wei) 70%-80%。
3） 凍存液：90%培養(yang) 基，10%DMSO，現用現配。液氮儲(chu) 存。
二． 細胞處理：
1） 複蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yang) 基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養(yang) 基後吹勻。然後將所有細胞懸液加入培養(yang) 瓶中培養(yang) 過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yang) 基，培養(yang) 過夜）。第二天換液並檢查細胞密度。
2） 細胞傳(chuan) 代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳(chuan) 代培養(yang) 。
對於(yu) 貼壁細胞，傳(chuan) 代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yang) 上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於(yu) 培養(yang) 瓶中，置於(yu) 37℃培養(yang) 箱中消化1-2分鍾，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養(yang) 瓶後加少量培養(yang) 基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補加培養(yang) 基，輕輕打勻後吸出，在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，補加1-2mL培養(yang) 液後吹勻。
4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yang) 基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yang) 基後加入少量，細胞變圓脫落後，加入約1ml含血清的培養(yang) 基後加入凍存管中，再添加10%DMSO後進行凍存。
冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置於(yu) 4℃ 30~60 分鍾→ （-20 ℃30 分鍾*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲(chu) 存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置於(yu) 已設定程序之可程序降溫機中每分鍾降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chu) 存。-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
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